BluePippin — система препаративного электрофореза и пульс-электрофореза, позволяет разделять и выделять фрагменты НК, размером 90-50000 п.н., а так же белки массой 18-200 кДа.
В системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК-маркера.
Преимущества
- Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов;
- Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования;
- Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации;
- Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов;
- Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.
4 режима программирования
- Tight (узкий) – сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров;
- Range (диапазон) – пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования;
- Time (время) – коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования;
- Peak (пик) – сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).
3 стратегии детектирования фракций
- Для ДНК малых размеров (90 п.н. -1,5 тыс.п.н.):
Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые маркеры ДНК, определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.
- Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п.н.):
Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый маркер ДНК определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
- Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п.н.):
Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
